Implications of post-transcriptional modifications in the regulation of MITF activity in vivo : a crucial transcription factor for the melanocyte lineage
Implications des modifications post-transcriptionnelles dans la régulation de l'activité de MITF in vivo : un facteur de transcription essentiel pour la lignée mélanocytaire
Résumé
The Microphthalmia associated transcription factor MITF and the Mitotic Activated Protein Kinase signaling pathway (MAPK) are crucial elements for the differentiation, proliferation and survival of melanocytes. The alteration of one of these two elements results in the impairment of this cell type. In contrast, in most cases, melanoma is associated with a constitutive activation of the MAPK pathway and often with a gain-of-function of MITF. In order to study interactions between the MAPK pathway and MITF activity, we focused our insterest on post-translational modifications that give rise to multiple isoforms of different activities. In fact, MITF contains a phosphorylation site, Serine-73 (S73), which has been implicated both in the increase of activity and the degradation of MITF protein in vitro. To assess the role of this S73 in vivo, our group previously generated targeted mice harboring a S73A mutation in the Mitf gene. However, the S73 codon is part of an Exon Splicing Enhancer sequence, whose mutation leads to a decreased binding affinity of the splice regulatory protein SRp40 and exclusion of exon 2B coding for that serine. In order to dissociate potential effects of residue-73 mutation from the exclusion of exon 2B, we retargeted Mitf in a way that renders the 5' splice site of exon 2B non-functional and force the incorportation of exon 2B. The phenotypic analysis of 3 new alleles Mitf S-S73A, SS73D and SS73-S demonstrates a gain-of-function of the non-phosphorylatable MITF 2B+ isoform.
Le facteur de transcription Microphthalmia (Mitf) et la voie de signalisation des " Mitotic Activated Protein Kinase " (MAPK) sont des éléments déterminants pour la différentiation, la prolifération et la survie des melanocytes. L'altération des fonctions de l'un ou l'autre se manifeste par une perte totale ou partielle de ce type cellulaire. A l'inverse, le mélanome est associé très majoritairement à une activation constitutive des MAPK, et parfois, à un gain d'activité de MITF. Afin d'étudier les interaction entre les MAPK et l'activité de MITF, nous nous sommes intéressés aux modifications post transcriptionnelles qui permettent la génération d'isoformes multiples dotées d'activité différentes. MITF contient un site de phosphorylation, la serine 73 (S73), qui a été démontré par le passé comme jouant un rôle à la fois dans l'augmentation de l'activité et dans la réduction de la stabilité de MITF in vitro. Pour comprendre le rôle de cette serine in vivo, une tentative de mutation S73A de Mitf a été réalisée. Ce codon fait parti d'un " Exon splicing Enhencer " et sa mutation réduit l'affinité de fixation de la protéine SRp40 et l'exclusion de l'exon 2B dans lequel est situé ce site de phosphorylation. Pour dissocier l'exclusion de l'exon 2B et de sa phosphorylation, nous avons donc altéré la jonction de l'exon 2A-2B afin qu'elle ne soit plus reconnue par le spliceosome. En conséquence, l'exon 2B ne peut plus être exclu des transcrits Mitf quelque soit le statut du codon 73. La comparaison de 3 nouveaux allèles Mitf S-S73A S-S73D et S-S73S, où l'inclusion de l'exon 2B est forcée, nous a permis d'associer l'absence de phosphorylation à un gain d'activité de MITF.
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